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减毒流感病毒载体疫苗下游工艺解决方案

2021-12-18 18:37:49

减毒流感病毒载体新冠疫苗:利用减毒的流感病毒作为载体,携带新冠S蛋白或S蛋白片段(如RBD),共同刺激人体产生针对两种病毒的抗体。

代表企业:

华兰生物疫苗股份有限公司

北京万泰生物药业股份有限公司

青岛海华生物医药技术有限公司

减毒流感病毒载体疫苗下游工艺解决方案

01、细胞培养

用苏州蓝晓生物科技的Seplife® LX-MC-dex1微载体培养MDCK细胞。微载体培养是目前公认最具发展前途的一种动物细胞大规模培养技术,其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点,且容易放大。蓝晓科技的微载体广泛应用在疫苗、单抗、基因治疗病毒载体等生物制品的大规模生产中,蓝晓科技自主研发的Seplife® LX-MC-dex1细胞培养微载体几乎适合所有贴壁细胞(如Vero、CHO、293T及MDCK等),细胞可贴附微球 2D 表面生长,1g的Seplife® LX-MC-dex1微载体提供 4400 cm2的表面积给细胞贴附。

图1:Seplife® LX-MC-dex1细胞培养微载体培养效果(来源:蓝晓科技)

02、固液分离

细胞培养后,先经过离心的方式固液分离去除培养基中水及培养基组分中的物质;

03、细胞洗涤

固液分离后收集细胞,可以用生理盐水重悬细胞,对细胞进行洗涤(工业上此工序可省略),保持细胞破碎时破碎的是纯净的细胞;


04、细胞重悬

细胞洗涤后,重悬细胞,重悬细胞要注意重悬缓冲液的种类及和重悬后的细胞浓度,浓度影响后面破碎效率,缓冲液影响后续纯化过程,尽量保持和下游工艺的合理衔接,避免置换缓冲液;

05、细胞破碎

重悬后可以用去污剂Tween20.Tween80.Triton X-100等破碎细胞,或者通过冻融的方式破碎细胞,破碎后可以测定病毒滴度,保证病毒全部释放出来;

06、破碎液固液分离

破碎后再次离心固液分离,收集上清;

07、澄清

上清液在用微滤(GF)的方式进行澄清处理(要特别注意澄清度,澄清度是影响后续层析填料及超滤(UF)膜组件使用寿命的关键因素之一),澄清度可以通过测浊度的方式检测;

08、核酸酶处理

澄清后加入核酸酶处理,降解核酸降低粘度,考虑核酸酶活加入的量及酶处理时间,核酸酶处理时要缓慢搅拌,保证处理的均匀性;

09、缓冲液置换

用超滤膜组件进行缓冲液置换,保证缓冲体系适合下一步层析过程,同时置换时也可以适当浓缩,注意超滤时的跨膜压及超滤时剪切力对病毒完整性的影响;若8工序后的样品不影响粗纯的层析过程(需要从细胞重悬工序开始合理选择缓冲液,及破碎方式的选择考虑)此工序可省去;

10、粗纯

减毒流感病毒载体新冠疫苗可用阴离子交换层析吸附——洗脱模式(大多数病毒在中性pH环境中都带负电荷)进行粗纯及浓缩,推荐使用苏州蓝晓生物高刚性琼脂糖微球阴离子交换填(Seplife large scale Q ),离子交换层析的过程,病毒被吸附在填料上,吸附的过程也会把病毒浓缩在填料上,苏州蓝晓生物的Seplife large scale Q填料吸附减毒流感病毒载体的载量在1-3mg/ml(与工艺缓冲液,层析时保留时间等有关),用阴离子交换层析吸附——洗脱模式粗纯减毒流感病毒载体新冠疫苗时,可以运用DOE,系统的表征各个层析工艺参数,达到最优的纯化结果(回收率和纯度),减轻后续精纯工序的压力;

同时也可以用苏州蓝晓生物的混合模式层析介质Seplife® Suncore 700来粗纯,病毒颗粒被排阻在惰性层外流穿,HCP,HCD,内毒素等杂质进入活性区域和介质以静电力,疏水作用力结合,从而实现分离。

图2:混合模式层析介质分离减毒流感病毒载体疫苗原料示意图(自制)

11、精纯

粗纯得到样本,在通过凝胶过滤层析进一步精细纯化,减毒流感病毒载体分子尺寸比较大(如H1N1病毒分子尺寸在80-120nm,不同型的流感病毒分子尺寸有差异),苏州蓝晓生物Seplife 4FF琼脂糖基质凝胶过滤填料的平均孔径在50nm,用此填料减毒流感病毒载体新冠疫苗被排阻在填料孔道外部,通过填料颗粒间隙流穿,而其它杂质如HCP,HCD,核酸酶等分子尺寸比较小,进入道填料通过扩散的作用进入道填料孔道内部,然后在通过扩散的作用散出填料孔道,这个过程中同样的缓冲液作用,扩散过程需要更多的热力学动力(即需要更多的缓冲液作用),而伴随缓冲液流动的病毒粒子需要的动力小伴随缓冲液一起流出,通过整个凝胶过滤柱床反复的分离,病毒颗粒在填料柱床的外水体积(即填料颗粒之间的间隙空间,约占柱床体积的30%),病毒分子最先流出柱床,其它物质后面流出柱床,即可实现减毒流感病毒载体新冠疫苗的精细纯化。

12、超滤浓缩

超滤浓缩换液及调整病毒粒子浓度

13、除菌过滤及制剂分装

0.22um除菌过滤后,在制剂化及包装。

苏州蓝晓生物科技有限公司

细胞培养微载体

Seplife® LX-MC-dex1

高刚性琼脂糖微球阴离子交换介质

Seplife large scale Q

高刚性高分辨率琼脂糖微球阴离子交换介质

Seplife large scale Q HP

多模式复合型层析填料

Seplife® Suncore 700

凝胶过滤层析填料

Seplife 4FF

苏州蓝晓生物科技有限公司,生物制药下游工艺解决方案专业供应商!

—— 代表产品 ——

✪高流速琼脂糖介质

离子交换填料:DEAE/Q/CM/SP seplife® FF等

凝胶过滤填料:seplife® 4FF/6FF等

疏水填料:Phenyl/Butyl seplife® FF等

亲和填料:Ni/Blue/rProtein A seplife® FF等

✪超高载量琼脂糖介质

DEAE/Q/CM/SP seplife® XL等

✪葡聚糖介质

凝胶过滤填料:seplife®  G25/G50/G75等

离子交换填料:DEAE/Q seplife® A25/A50等

CM/SP seplife® C25/C50等

✪高刚性琼脂糖介质

seplife® large scale Q/SP/DEAE等

✪聚合物介质

seplife®RP/IEX/HIC等

✪多模式介质

seplife® large scale MMC/MMC(Ⅱ)等

seplife® large Suncore 700等

seplife® LH-20等

✪细胞培养微载体

seplife® LX-MC-dex 1等

✪核酸固相合成载体

交联苯乙烯(羟基、氨基)等

✪多肽合成载体

Merrifield树脂/Wang 树脂等

✪酶固定化载体

seplife® LX-505P/LX-1000EP/EP200等

现高流速琼脂糖介质,超高载量琼脂糖介质,高刚性琼脂糖介质,葡聚糖介质,单分散聚合物介质,多模式介质,细胞培养微载体,核酸固相合成载体,多肽固相合成载体,酶固定化载体等年产均超过50000升。





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