Vero细胞
Vero胞(非洲绿猴肾细胞)是日本学者Yasumura和Kawakita两人在1962年正式从非洲绿猴肾脏分离的，初次用于生产人用生物制品的异倍体贴附依赖性细胞，并建立了细胞系和不同代次的细胞库。在此之前，对生物制品的研究和生产只允许用原代细胞或二倍体细胞。
近年来随着生物技术的发展，动物细胞培养技术已从简单的试验研究拓展到了生物学研究和商业应用领域。生物制品如病毒性疫苗、医学治疗性抗体的研究与生产都用到了细胞培养技术。
Vero细胞在病毒类生物制品生产上的应用
➤新冠病毒灭活疫苗
➤狂犬病毒灭活疫苗
➤轮状病毒疫苗
➤流行性乙型脑炎病毒疫苗
➤肠道病毒 71 型疫苗
➤脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)
➤口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)
1987年，WHO才正式批准传代细胞系作为生物制品生产的基质。Vero细胞被批准用于人用疫苗的生产后，开始生产的人用疫苗是Barrett等生产的脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)，之后Vero细胞用于狂犬病毒疫苗和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)等多种人用疫苗生产。Vero细胞在病毒性疫苗生产的应用已有30年之久，尤其是狂犬病毒疫苗和脊髓灰质炎疫苗。
Vero细胞的优势
➤容易建立细胞库和保存，可连续传代，生长速度快；
➤Vero 细胞遗传性状稳定，恶性化概率小，无外源性污染，具有良好的生物安全特性；
➤Vero 细胞对多种病毒敏感，生产的病毒滴度高；
➤Vero 细胞对培养条件要求不高，在微载体表面能良好的贴附生长，易在生物反应器放大培养。
大规模反应器微载体培养Vero细胞
驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血清培养基内生长。带有详细传代记录的Vero细胞冻存管被复苏；并传代到T形瓶和滚瓶中，生产出足够数量的细胞以接种Seplife LX-MC-dex1微载体生物反应器。细胞汇合后， 细胞按照大约1:7的比例传代到后面的生物反 应器。最终的细胞密度在2-3×106/ml。
微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。将对细胞无害的微载体颗粒加入培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩增三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，因此细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。细胞主要通过静电引力和范德华力与微载体黏附，这取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。
图片来源：科兴中维生物反应器微载体培养的vero细胞显微镜下观察的照片_百度图片搜索 (baidu.com)
蓝晓科技的微载体广泛应用在疫苗、单抗、基因治疗病毒载体等生物制品的大规模生产中，蓝晓科技自主研发的Seplife LX-MC-dex1细胞培养微载体在Vero细胞、CHO细胞、293T细胞及MDCK细胞等已广泛用于生物制品的大规模生产中，细胞可贴附微球 2D 表面生长，1g的Seplife LX-MC-dex1微载体提供 4400 cm2的表面积给细胞贴附。
Seplife LX-MC-dex1技术参数
细胞生长曲线
Vero细胞在两家不同批次微载体的培养基中，24h至96h细胞生长曲线如图1所示。
图1：蓝晓科技细胞培养微载体和进口微载体用于Vero细胞培养生长曲线
细胞生长情况观察
图2：蓝晓科技细胞培养微载体用于Vero细胞培养细胞生长情况观察
Seplife LX-MC-dex1微载体的应用领域非常广泛，基于微载体生产的疫苗除了新冠以外，还包括脊髓灰质炎、风疹、狂犬病、流感、日本脑炎（乙型脑炎）、呼吸道合胞病毒（RSV）和口蹄疫（FMD）疫苗等。与其他细胞培养工艺相比，微载体培养工艺可以提高产量，降低成本，并减少污染。
Seplife LX-MC-dex1微载体使用方法
1.微载体预处理
首先，干燥的微载体在无 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸缓冲液（PBS pH=7.4，每克微载体加50-100ml）中在室温下浸泡膨胀至少 3 小时。然后，弃去上清液，用新配制的无 Ca2+ 、Mg2+ 的PBS（pH=7.4，每克微载体加30-50ml）洗涤微载体数分钟。接着，弃去 PBS，换上新的无 Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS（pH=7.4，每克微载体加 30-50ml）。之后，微载体溶液用高压灭菌法灭菌（115℃，15min，15psi）。微载体Seplife LX-MC-dex1 非常稳定，可以反复（至少5次）长时间 （130°C，12h，27psi）进行高压灭菌而不影响其性能。灭菌结束后使用前，加入培养基润洗置换（20-50ml/g），之后加入 10%血清或无血清培养基放置过夜。
2.微载体培养
准备好消化好的细胞，连同之前准备好的微载体一起加入方瓶或反应器中（微载体加量 1-5g/L），在一定条件下开始培养，4 小时后观察细胞贴附情况。如果细胞贴附良好，继续跟踪培养，观察细胞生长情况。
3 微载体培养操作要点
（1）培养初期：
保证培养基与微球体处于稳定的 pH 与温度水平，接种细胞（对数生长期， 而非稳定期）至终体积 1/3 的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。常使用 2-3g/L 的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时， 维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度 75r/min。
（2）贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质 混合。
（3）培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增 殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过 3d 左右，培养液开始呈酸性，需换液。具体方 法：停止搅拌，让微珠沉淀 5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重 新开始搅拌。
（4）收获细胞：首先，排干培养液，至少用缓冲液漂洗 1 遍；然后，加入相应的酶，快速 搅拌（75-125r/min）20-30min；最后，解离收集细胞及其产品。
（5）微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或 原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至 4000L 以上。
Seplife LX-MC-dex1微载体订购信息
