抗体药制备工艺中聚集体及片段的去除解决方案

蓝晓科技rProtein A填料通过FDA DMF备案

蓝晓科技自主开发拥有专利的rProtein A系列蛋白A亲和填料于2022年7月14日通过美国FDA DMF备案（MF#：037326），成为国内为数不多的通过FDA DMF备案的国产填料供应商。这意味着使用蓝晓科技相关产品的客户，在向FDA提交进行新药注册的监管备案文件中可直接引用DMF备案资料，而无需再提供有关原料和辅料的具体信息。

FDA DMF备案rProtein A填料介绍

rProtein A Seplife Suno是蓝晓科技应对抗体客户需求推出的Protein A亲和层析填料，以球形，高交联琼脂糖凝胶为基质，通过自主创新技术将耐碱性重组蛋白A键合到该基质上。可以特异性地与抗体的Fc区结合，用于抗体（单抗和多抗）的分离纯化，只需一步亲和层析，即可从腹水、血清或培养液等样品中得到高纯度的抗体。

具有以下特点

✔自主研发，品质保证，专利保证 

✔高载量：5min保留时间载量80mg/ml

✔耐碱性好：耐受0.5M NaOH

✔完整的支持文件：RSF、DMF、MSDS、TSE/BSE

✔低配基脱落：小于 2 ppm

✔货期短，1-2周可以交

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概论

重组IgG类抗体在表达过程中经常伴随着相对较高水平的产品相关杂质，这些杂质主要从重链同二聚化、重链-轻链错配、不同链的不平衡表达和分子间错联引起的。尽管通过使用抗体设计策略可以提高正确配对率,但是完全避免是不可能的。同时在经典三步法层析纯化抗体的工艺中，Protein A 亲和层析低pH洗脱及低pH病毒灭活的过程也会产生一部分聚集体，然而其中一些副产品与目标 IgG生物特性比较相似，它们的去除对下游工艺提出了重大挑战。抗体药制备工艺中聚集体及片段的去除是抗体药下游工艺的重要组成部分。

Protein A亲和层析阶段

Protein A 亲和层析时通常用pH5.0的缓冲液加1M NaCl进行淋洗以减少洗脱液中HCP的残留，再用pH 3.5的缓冲液一步洗脱IgG分子，没有很好的达到去除聚集体和片段的效果，但一些研究表明在pH 线性梯度洗脱条件下半抗主要集中在前锋，填料的分辨明显提高了,因半抗包含一个Fc区，所以比双抗蛋白跟填料结合力比较弱，容易洗脱下来。同时Protein A亲和层析阶段去除聚集体及片段也受其结合载量，特异性，分辨率等多种因素的影响。

多模式层析去除聚集体及片段

图1：蓝晓科技多模式层析结构示意图

多模式层析去除抗体中的聚集体及片段案例：

样品：rProtein A Seplife Suno洗脱液(pH7.83， cond:11.84mS/cm，conc:1.3145mg/ml，NR-CE 73.6%)

多模式介质：MA Large Scale

层析柱：5ml预装柱

线性流速：150cm/h

A液:50mM Na2HPO4-CA，pH8.0，cond 7.5mS/cm

B液: 50mM Na2HPO4-CA，1M NaCl，pH5.0，cond 92.7mS/cm

图2：多模式层析pH和盐双梯度色谱曲线图

多模式层析去除聚集体结果

多模式层析MA Large Scale 吸附-洗脱模式下用pH和盐双梯度洗脱，比单pH梯度或单盐梯度洗脱有着更高的分辨率，NR-CE的去除率可达99.6%。

凝胶过滤层析去除抗体中的聚集体及片段

烯丙基葡聚糖高分辨率凝胶过滤介质具有独特的化学结构和良好的理化性能，柱层析操作时能获得很高的流速、分辨率和回收率。该层析介质广泛应用于酶、多糖、核酸和蛋白质等生物大分子的分离纯化，γ-干扰素、白介素-Ⅱ、蛋白质A和乙肝疫苗等生物制品生产过程中，且广泛用于生物大分子单体和聚集体及片段的分离。

凝胶过滤层析去除抗体中的聚集体及片段案例

样品：rProtein A Seplife Suno洗脱峰，SEC%（聚集体18.2，主峰80.8，片段1.6）

缓冲液：50mM Tris HAc 150mM Arg HCl pH7.0

层析填料：蓝晓科技Seplife S-200

层析柱：蓝晓科技16mm*700mm，装填高度620mm

流速：2ml/min

层析结果：Seplife S-200层析介质洗脱峰SEC%(片段0，主峰99.8，聚集体0.4），聚集体及片段去除率达到98%。

参考资料

[1] Y. Li, A brief introduction of IgG-like bispecific antibody purification: methods for removing product-related impurities, Protein Expr. Purif. 155 (2019) 112–119.

[2] J.B. Ridgway, L.G. Presta, P. Carter, 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization, Protein Eng. Des. Sel. 9 (1996) 617–621.

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