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丝氨酸蛋白酶下游工艺解决方案

2023-12-11 13:10:15
丝氨酸蛋白酶


丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族,它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键,使之成为小分子蛋白质。在哺乳类动物里面,丝氨酸蛋白酶扮演着很重要的角色,特别是在消化,凝血补体系统方面。其激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的,它们之中一定有一个是丝氨酸。


丝氨酸蛋白酶的特点是具有独特的结构,由两个在催化活性位点会聚的β-桶结构域组成。这些酶可以根据它们的底物特异性进一步分类为胰蛋白酶样、胰凝乳蛋白酶样或弹性蛋白酶样。


胰蛋白酶样

胰蛋白酶样蛋白酶在带正电荷的氨基酸(赖氨酸或精氨酸)之后切割肽键。这种特异性是由位于酶S1口袋底部的残基驱动的(通常是带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸)。


胰凝乳蛋白酶样

胰凝乳蛋白酶样酶的S1口袋比胰蛋白酶样蛋白酶更疏水。这导致对中到大尺寸疏水残基的特异性,例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。


类凝血酶

这些包括凝血酶、组织激活型纤溶酶原和纤溶酶。已发现它们在凝血和消化以及神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏症和帕金森氏诱发的痴呆症)的病理生理学中发挥作用。


类弹性蛋白酶

弹性蛋白酶样蛋白酶的S1裂缝比胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶小得多。因此,残基如丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸往往是优选的。


枯草杆菌蛋白酶

枯草杆菌蛋白酶是原核生物中的一种丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶在进化上与胰凝乳蛋白酶家族无关,但具有相同的催化机制,利用催化三联体来产生亲核丝氨酸。这是用来说明趋同进化的经典例子,因为同一机制在进化过程中独立进化了两次。



苯甲眯


苯甲脒类物质是丝氨酸蛋白酶的广谱抑制剂,所以将这类物质偶联到琼脂糖微球上,可从各种来源的样品中一步纯化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽释放酶、前激肽释放酶等丝氨酸蛋白酶。


苯甲眯高流速琼脂糖微球亲和介质


苯甲眯高流速琼脂糖微球《Benzamidine Seplife 4FF》是蓝晓科技自主研发的一种特异性结合丝氨酸蛋白酶的亲和层析介质,具有良好的化学稳定性和生物相容性。它是将苯甲脒类物质偶联到高流速琼脂糖凝胶过滤层析介质上,可以从各种来源的样品中进一步纯化胰蛋白酶,凝血酶,尿激酶,激肽释放酶,前激肽释放酶等丝氨酸蛋白酶。Benzamidine Seplife 4FF层析介质运用新的活化方法,具有流速高,非特异吸附少,分离效果好的特点,是纯化丝氨酸蛋白酶类最合适的层析介质。


Benzamidine Seplife 4FF推荐使用条件

➤平衡缓冲液:0.05mol/L Tris-HCl 0.5mol/L NaCl pH7.4

洗脱方式一般有3种:

➤竞争洗脱:在缓冲液中加入20mmol/L的p-氨基苯甲脒。

➤pH洗脱:如0.05mol/L甘氨酸-HCl,pH3.0或者0.01mol/L HCl 0.5mol/L NaCl,pH2.0。

➤变性洗脱:如在洗脱缓冲液中加入8M尿素或6M盐酸胍等。

➤注意:如果使用低pH洗脱条件,在收集的洗脱液中需要加入1M Tris-HCl, pH=9溶液,防止由于低pH导致的洗脱蛋白变性,一般每毫升洗脱液加入60-200ul。

➤保存:保存条件为20%乙醇/乙酸缓冲液(乙酸缓冲液pH=4),储存温度2~8℃。

更多信息请联系苏州蓝晓生物:0512-65160522


应用案例:胰蛋白酶亲和层析纯化

层析条件

层析柱:26mm*200mm ;装柱高度:100mm;

装填填料:Benzamidine Seplife 4FF

流速:5 ml/min;

缓冲液A:Tris-HCl + NaCl;

缓冲液B:Tris-HCl;

样品说明:胰糜蛋白酶粗品

图1:Benzamidine Seplife 4FF纯化胰蛋白酶色谱图


亲和层析结果分析:应用案例:胰蛋白酶亲和层析纯化

分别对原液、流穿液、洗脱液中蛋白浓度和胰糜蛋白酶的效价进行测定。蛋白浓度通过紫外吸收法,效价测定根据中国药典2015年版胰糜蛋白酶的效价测定方法

项目

糜效u/mg

胰效价u/mg

上样液

1109

990.81

流穿液

1447.46

0

洗脱液

0

2660.38

中国药典2015年版规定糜蛋白酶的效价不小于1000单位/mg;胰蛋白酶效价不得少于2500单位/mg。由此可以看出蓝晓科技开发生产的Benzamidine Seplife 4FF亲和层析介质可以用来生产满足药典要求的胰蛋白酶和糜蛋白酶。

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