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抗体药纯化工艺过程中常见问题及解决方案

2023-12-11 14:49:21

mAb纯化工艺过程中常见问题及解决方案

单克隆抗体制备过程中,细胞培养的上清液经过深层过滤等方式进行澄清,澄清后用rProtein A Seplife Suno捕获及初步纯化,初步纯化在经低pH(pH3.4-3.8)灭活病毒,对于在低pH环境中不稳定的mAb可采用S/D的方式灭活病毒,灭活病毒后用阳离子交换 SP Large Scale 吸附洗脱模式继续纯化,进一步去除HCP及亲和层析过程中可能脱落的 Protein A 亲和配体,同时阳离子交换层析过程通过改变pH的方式洗脱也是去除电荷异构体的主要方式,阳离子交换层析后用阴离子交换层析Q Large Scale进一步精细纯化去除痕量的病毒及HCP等杂质,聚集体及片段的去除也多在离子交换层析阶段去除。经基于Protein A亲和层析平台技术的三步层析后,在通过UF/DF的方式置换缓冲液,纳滤除病毒等即可制剂化。


mAb纯化过程中常见问题

Protein A亲和洗脱过程中产生沉淀:

高载量的Protein A亲和层析填料结合mAb的过程中,在填料表面高密度聚集,疏水性强的mAb分子容易高密度聚集沉淀,这个时候可以尝试在洗脱液中添加一些蛋白增溶剂,防止高密度聚体引起的沉淀,如 200mM-500mM 的 Arg 或 1M尿素等。另一方面在低pH洗脱过程中,mAb分子在低pH环境中不稳定时也容易形成沉淀,这时可用较高的pH如pH4.0在加一定量如500mM Arg进行弱洗脱,同时洗脱下来要立马用 1M Tris等缓冲液中和pH。


Protein A亲和层析洗脱液中HCP残留过高:

关注蓝晓生命科学公众号,关注后,在搜索处搜索HCP,查看《抗体纯化中Protein A亲和层析阶段HCP去除策略》推文。另一种方式是亲和层析后在进行一步深层过滤,这时选择的深层过滤膜组件可选择带阴离子交换作用的膜组件。


Protein A亲和层析洗脱液中聚集体含量偏高:

由于mAb分子在Protein A亲和层析填料中高密度产生聚集体,这时可通过降低mAb的结合量一方面减少保留时间另一方面降低上样量,同时也可通过在结合缓冲液中增加一些蛋白增溶剂如尿素,盐等物质减弱mAb分子之间的作用,而减少洗脱液中的聚集体含量。


低pH病毒灭活过程中活性损失大:

在一些mAb分子低pH病毒灭活过程中,由于其AA组成,等电点,稳定性等因素可能导致mAb分子降解及聚集等而影响mAb的活性收率,这时就要考虑其它病毒灭活方式,如S/D。S即solvent,指有机溶剂,D即detergent,指去垢剂,S/D病毒灭活法即指采用有机溶剂和/或去垢剂对产品中可能存在的病毒颗粒进行灭活,使其失去感染活性的一种病毒灭活方法。S/D病毒灭活时,最主要使用的有机溶剂为TNBP;最主要使用的非离子型去污剂为Triton X-100、Tween 80,其中Triton X-100去垢剂能力更强。病毒灭活时,TNBP可单独使用,也可以与去垢剂中的任意一种联合使用。S/D病毒灭活时,TNBP常用浓度0.1%-0.5%,Triton X-100浓度常用1%。


离子交换层析后电荷异构体含量高:

关注蓝晓生命科学公众号,关注后,在搜索处搜索电荷异构体,查看《单克隆抗体电荷异构体去除策略》推文。


离子交换层析精纯后聚集体及片段含量高:

关注蓝晓生命科学公众号,关注后,在搜索处搜索聚集体,查看《抗体药制备工艺中聚集体及片段的去除解决方案》推文。


精纯后一些糖基化分子的去除:

关注蓝晓生命科学公众号,关注后,在搜索处搜索糖基化,查看《糖基化蛋白的分离纯化》推文。


小结:此文总结是蓝晓科技应用开发部,在纯化抗体中多个项目工艺过程的总结,在不同的mAb分子纯化过程中会有所差异,仅供参考,更多mAb纯化过程中常见问题及解决方案,请留言补充。




mAb下游纯化案例

基于Protein A亲和平台技术三步层析法纯化mAb:

样品:某mAb原液经深层过滤后的上清液

图1:rProtein A Seplife Suno纯化mAb色谱曲线


图2:SP Large Scale精细纯化mAb色谱曲线

图3:Q Large Scale精细纯化mAb色谱曲线

图4:三步层析后HPLC-SEC检测图


纯化结果:mAb三步层析法纯化后SEC纯度99.15%;总收率 84.50%;HCP残留5 ppm,如表1.

表1:蓝晓科技三步层析法纯化mAb结果


rProtein A Seplife Suno:

是蓝晓科技应对抗体客户需求推出的Protein A亲和层析填料,以球形,高交联琼脂糖凝胶为基质,通过自主创新技术将耐碱性重组蛋白A键合到该基质上。可以特异性地与抗体的Fc区结合,用于抗体(单抗和多抗)的分离纯化,只需一步亲和层析,即可从腹水、血清或培养液等样品中得到高纯度的抗体。在mAb纯化中用于捕获及初步纯化,mAb载量高达80mg/ml。

蓝晓科技自主开发拥有专利的rProtein A系列蛋白A亲和填料于2022年7月14日通过美国FDA DMF备案(MF#:037326),成为国内为数不多的通过FDA DMF备案的国产填料供应商。这意味着使用蓝晓科技相关产品的客户,在向FDA提交进行新药注册的监管备案文件中可直接引用DMF备案资料,而无需再提供有关原料和辅料的具体信息。


rProtein A Seplife Accel 50

蓝晓科技为了满足单克隆抗体(mAb),双特异性抗体(bsAb),多特异性抗体,抗体偶联药(ADC)等各种抗体药大规模生产需求设计开发的以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为基质,偶联高耐碱性重组Protein A 配基亲和层析介质。该产品结合了蓝晓科技专有喷射法单分散微球制备、精准造孔、表面修饰(长链间隔臂亲水改性),配基偶联等技术使得产品具有高刚性、低反压、高动态载量、媲美软胶的生物相溶性,聚体去除效率高等优点,与公司琼脂糖基质Protein A亲和介质形成完整的产品组合,可有效满足不同客户多元化的应用场景。


SP/Q Large Scale 

用于mAb纯化过程中精细纯化,去除亲和层析过程中可能脱落的Protein A及HCP,电荷异构体,聚集体及片段。此系列填料为高刚性琼脂糖微球填料,耐压可达0.5MPa,广泛用于生物分子的分离纯化。


Seplife LXPM Q/SP 5504M/S

聚合物离子交换层析填料,其耐压可达0.8MPa,用于mAb中度及精细纯化。


MMC/MA Large Scale 

以离子交换为主同时兼具一定的疏水作用力的多模式层析填料,pH伴随盐双梯度洗脱模式广泛用于mAb纯化过程中聚集体及片段的去除。


Seplife S-200

用于mAb纯化过程中精纯阶段残留的聚集体及片段的去除。


Boricacid Seplife 4FF及硬胶Boricacid Seplife LXPM 5504

由于硼酸反应的专一性,硼酸盐亲和材料近年来受到越来越多的关注。已证实硼酸盐亲和材料可以有效分离包括糖蛋白在内的含顺式二羟基结构的化合物。硼酸分子与糖链上的顺式二羟基结构在碱性条件下形成环酯,该生成物在酸性条件下容易水解,反应原理如图2所示。基于该可逆反应,可利用硼酸盐亲和材料选择性检测分离富集糖基化蛋白。用于mAb纯化过程中糖基化蛋白的去除。

图5:硼酸亲和层析分离糖基化蛋白的原理



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