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病毒纯化多模式层析介质应用指南

2022-06-20 10:46:26

壳层技术多模式层析介质简介

壳层技术多模式层析介质,是蓝晓科技自主研发的一种新型多模式琼脂糖层析介质,用于病毒等生物大分子的中度纯化和精细纯化。该层析介质运用新型壳层微球技术及辛胺配基,具有凝胶过滤和吸附分离双重功能。核心功能区键合强吸附配体辛胺,以静电力及疏水作用力在宽泛的pH和离子强度下结合分子,同时核心功能区外层有约5um的壳层,壳层上有700 KDa / 400 KDa的空隙和核心功能区连通。新型壳层微球技术可有效捕获污染物,同时使目标分子流穿。Seplife Suncore 700 / 400层析介质具有高流速、低反压、高处理量、良好的化学稳定性和机械性等特点,方便进行规模放大,可缩短生产时间,提高生产效率。澄清的溶液流经柱床时,大于700 KDa / 400 KDa的生物分子被排阻在壳层外面,通过外水体积流穿,而小于700 KDa / 400 KDa的生物分子通过壳层的空隙进入核心功能区,并结合在核心中,从而在较高流速及较大上样量的状态,依然能超大生物分子和其它生物分子的分离。

图:壳层技术多模式层析介质结构示意图(蓝晓科技)

壳层技术多模式层析介质性能参数

壳层技术多模式层析介质的使用方法

1 装柱

装柱按照标准操作规程操作。必须保证每种材料都处于工作温度,凝胶装柱前需要脱气。

2 平衡

使用2~5倍柱床体积的上样平衡液平衡柱子,务必使流出液的电导和pH同上样缓冲液的电导和pH完全一致。平衡液可以是常规凝胶过滤和离子交换层析介质使用的缓冲体系,如磷酸盐缓冲液,Tris缓冲液;不建议使用醋酸缓冲体系,这样会降低层析介质的结合载量。

3 上样

一般情况是目标分子走流穿模式,杂质吸附在内部孔道。

实际上样量可以达到5-20柱体积,主要取决于样品的组成。

4 淋洗和再生

用平衡缓冲液淋洗柱子,结合的杂质可用在位清洗(CIP)除去。

5 在位清洗

为了去除捕获的污染物,维持产品的性能,需要定期进行在位清洗。建议在每个周期后使用含1.0 M NaOH的30%异丙醇溶液冲洗或者用27%的丙酮溶液反相冲洗,接触时间30-60min,中间可以在溶液中暂存15-30min,提高清洗效率。

NaOH的浓度、有机溶剂的种类、接触时间及在位清洗的体积都可以根据实际样品进行优化。

6 消毒

可以使用0.5-1.0M NaOH溶液过柱,接触时间1h,对使用过的层析柱进行消毒。

7 存储

密封保存在4~30℃(保存溶液为20%乙醇)干燥、通风、清洁处,不可冷冻;用过的柱子保存在4~8℃,20%乙醇溶液中。

8 运输

运输中避免日晒、雨淋、重压,严禁与有毒、有害物品混运。

Seplife Suncore  400应用

用进口CORE 400和蓝晓Seplife Suncore 400同时平行纯化手足口EV71病毒原液。

纯化结果:蓝晓科技Seplife Suncore 400和进口CORE 400在流穿,洗脱峰高及峰面积上均无明显差异,更多信息请联系蓝晓科技。

Seplife Suncore  700应用

用进口CORE 700和蓝晓Seplife Suncore 700同时平行纯化澄清的流感病毒原液。

壳层技术多模式层析介质的应用范围

1. 病毒类生物制品的流穿模式纯化

用于制备灭活疫苗及弱毒活疫苗的病毒均可用壳层技术多模式层析介质进行纯化,如狂犬病毒,流感病毒,手足口病毒等。病毒粒子>700 KDa (约30nm)时可选用Seplife Suncore 700 及Seplife Suncore 400,病毒粒子>400 KDa 选用Seplife Suncore 400。

2. 类病毒颗粒(VLPs)流穿模式

VLP疫苗也是当前疫苗制备的重要技术之一,如国内生产的乙肝疫苗全部采用VLP技术路线,如VLP乙肝疫苗的颗粒在22nm左右,可采用Seplife Suncore 400流穿模式纯化。

3. 病毒载体的流穿模式纯化

用于制备载体疫苗的病毒载体如腺病毒载体及减毒流感病毒载体均可用Seplife Suncore 700中度及精细纯化。同时用于细胞治疗及基因治疗的病毒载体如慢病毒(LV),逆转录病毒(RV)可以用Seplife Suncore 700进行纯化,腺相关病毒(AAV)可以用Seplife Suncore 400进行纯化。

4.pDNA的流穿模式纯化

用于制备核酸药物的pDNA可以用Seplife Suncore 700流穿模式纯化,pDNA经外水体积流穿,而RNA及HCP,内毒素等则通过壳层的空隙进入核心区域,结合在层析介质中,从而实现分离纯化。

5. 外泌体的流穿模式纯化

细胞分泌的外泌体通常在30-150nm的范围,澄清的细胞培养液经过壳层技术多模式层析介质Seplife Suncore 700时,外泌体被排阻在壳层外流穿,而HCP,HCD等杂质则通过壳层的空隙进入核心区结合在层析介质上,从而实现分离纯化。

6. 纳米载体的流穿模式纯化

随着技术的发展,纳米载体也被广泛用于基因治疗载体及新型疫苗的开发,纳米载体因颗粒比较大,也可以用Seplife Suncore 400/700进行流穿模式纯化。

壳层技术多模式层析介质的应用行业

1. 人用疫苗

主要用于病毒类疫苗,灭活疫苗制备时灭活病毒的流穿模式纯化,弱毒活疫苗制备时活病毒的纯化;核酸疫苗制备pDNA时,pDNA的流穿模式纯化;载体疫苗制备时病毒载体及纳米载体的流穿模式纯化;VLP疫苗制备时VLP的纯化。人用疫苗制备时,一步壳层技术多模式层析通常难以满足产品纯度要求,故在人用疫苗制备时,壳层技术多模式层析通常要联合离子交换层析如Q Large Scale,或联合凝胶过滤层析Seplife 4FF完成整个纯化过程。

2. 动物疫苗

和人用疫苗类似,不同的是,动物疫苗通常一步壳层技术多模式层析纯化后,即可满足产品纯度要求。

3.细胞及基因治疗

细胞及基因治疗,病毒类载体,从开始的pDNA制备,pDNA的纯化到病毒载体的纯化都可以用壳层技术多模式层析进行中度及精细纯化。同时在基因治疗行业非病毒载体中的纳米载体也可用壳层技术多模式层析进行分离纯化。

4. 其它行业

如IVD行业制备外泌体时,外泌体可以用壳层技术多模式层析进行分离纯化。

壳层技术多模式层析介质应用常见问题

壳层技术多模式纯化病毒时回收率低

因为病毒形状及结构影响,若用Seplife Suncore 700纯化时回收率低,可尝试用Seplife Suncore 400代替以提高回收率。

上样量小

上样量与原液中HCP等杂质含量有关,原液中杂质含量越高上样量越小,可以在上样通过UF/DF的方式去除小分子杂质,在进行壳层技术多模式层析。如用含有牛血清的培养基里面含量大量BSA,可在进行壳层技术多模式前用UF/DF去除大部分的BSA。

使用寿命短

使用寿命主要是由样品的澄清度决定,在进行层析时要充分澄清并用核酸酶处理,降低粘度,避免微小固体颗粒进入壳层的空隙影响其寿命。

更多关于壳层技术多模式层析介质使用的问题请联系蓝晓科技:

0512-65160522


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