概论
在结构研究和体外生物化学分析等很多实验应用中都需要用到纯化蛋白质。蛋白质可以从组织中获取，亦或更经常的是从模式生物中过量表达获得，如细菌、酵母或哺乳动物细胞培养等。蛋白质纯化主要是根据它们各不相同的物理性质来从原料进行分离，其目的就是希望能浪费最少的杂蛋白，获得最多的功能蛋白质。
亲和层析
亲和层析主要依靠蛋白质与介质配体间特异性的可逆结合作用进行分离。配体可直接与目标蛋白质结合，也可以与蛋白质共价结合的标签结合。亲和层析通常是一种最粗放的纯化过程，一般在纯化工艺的前期应用。基于后续应用的要求，可能只需要一步亲和层析即可获得纯度合格的蛋白质。
亲和层析的固定相是一种共价结合特异性配体的惰性介质，该配体可与一个蛋白质或一类蛋白质特异性结合。惰性介质通常是交联的琼脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白质可采用选择性或非选择性模式来进行亲和柱层析纯化。在选择性亲和柱层析中，一般使用对蛋白质有特异性作用的配体或共价结合的标签。在非选择性亲和柱层析中，如用于免疫球蛋白纯化的蛋白A、G、L，用于DNA结合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，这些配体与一类蛋白都具有相似的结合能力。
图 1. 用蛋白A、G、L进行亲和层析的原理示意图：A.抗体含有多个功能区：一类蛋白质的Fc区（片段，恒定区） 都是相同的，Fv区（片段，可变区）是每个抗体各不相同的特异区，Fab（片段，抗原区）是抗体实际与特异性抗原结合的区域。B.抗体的特异性区域可以通过亲和色谱进行非选择性纯化，在该过程中，配体 （蛋白 A、G、L）是结合在分离介质上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于纯化特异性蛋白。这种情况下，抗体作为中间配体为其抗原提供选择性。
两类亲和色谱中，在不影响蛋白质（或标签） 和配体间作用力的条件下，蛋白质均在柱上保留。在不破坏特异性相互作用但可破坏所有杂蛋白与固定相间其非特异性作用的条件下，对所有结合的蛋白质进行淋洗。最后用含有竞争分子的缓冲液或者可破坏所有蛋白质间相互作用的条件对结合蛋白进行洗脱。竞争分子可代替目标蛋白与配体相结合。这种竞争分子可通过其他层析手段或者透析的方式从目标蛋白中去除。通过破坏所有蛋白间相互作用来从固定相洗脱蛋白的方法包括调节缓冲液的pH值或者离子强度。因为这些方法同样会影响蛋白质的稳定性，因此通常建议洗脱下来的蛋白质要立即中和或者稀释以将危害降到最小。有报道称，对于不同形式的亲和层析，为获得最高产率的活性蛋白需采用多种不同的流动相条件 [13, 14] 。
设计蛋白质表达质粒时，即可在其N端或C端（或在少数情况下，在结构已知蛋白质的柔性环状区域） 引入亲和标签以助于纯化。
抗体通常是基于抗体与其抗原 （抗体识别的序列） 间的高特异性相互作用来进行纯化。一个含有抗原的多肽可以与带有抗体特异结合位点的介质相结合。降低流动相缓冲液的pH值可破坏抗体/多肽间相互作用力，释放出结合抗体。商业上，该方法常用于血清原液中抗体的纯化。
rProtein A Seplife Suno
高载量，高耐碱性，完善的支持文件。
蛋白质同样可通过非选择性方式进行亲和纯化。在非选择性纯化过程中，固定相上结合的配体可以与一类具有类似结合部位的蛋白质相结合。DNA结合蛋白质的纯化就是一个非选择性亲和层析的实例。因为肝素与DNA的结构和电荷极为类似，它可以被作为DNA结合蛋白质亲和层析的配体。由于所有的DNA结合蛋白质理论上都可以与该固定相结合，几乎其他所有蛋白质都会穿透而不与介质结合，从而可达到目标蛋白产率最大程度的富集。另一个例子是抗体通过其恒定区 （Fc）与配体间的相互作用进行富集浓缩，蛋白A、G、L都是常用的配体。
当采用类似的结合模式（抗体与蛋白A、 G或 L配体结合）时，抗体的抗原结合区（Fab）仍然保持与其特异性抗原结合的能力。因此，特异性蛋白可通过配体/抗体结合和抗体的抗原间的特异性相互作用来纯化。
常见问题及解决方式见表2。
离子交换层析
离子交换层析分离蛋白的原理是基于其净电荷的不同，通过蛋白质与带电荷的固定相之间的静电作用力进行分离。IEX有以下两类: （1）阴离子交换层析 （固定相带正电荷，与带负电的蛋白质相结合）；（2）阳离子交换层析（固定相带负电，与带正电的蛋白质相结合）。离子交换层析常用于蛋白质纯化工艺中期。但是，对某些蛋白，在纯化工艺的前期或后期采用该方法亦可获得良好的分离效果。
图 2. 蛋白质净电荷受其溶剂pH值影响。当pH=pI时，蛋白质净电荷为0，因此既不与阴离子交换的固定相也不与阳离子交换的固定相相结合。调节pH值高于或低于pI值可使蛋白质带上净电荷，使其与阴离子交换树脂（pH > pI）的固定相或者阳离子交换（pH < pI）的固定相相结合。
由于氨基酸的基本结构和与其共价结合的修饰成分的影响，所有的蛋白质都会带有净电荷。由于溶剂可以与蛋白质相互交换氢离子，因此蛋白质的净电荷受其溶剂pH值的影响。蛋白质的等电点（pI）是蛋白质不带电时的pH值。当pH值高于pI时，蛋白质会带负电，而当pH值低于pI时，蛋白质带正电。因此，可以通过调节溶液的pH值来控制结合蛋白是与离子交换柱结合或是从柱上洗脱。
SP Large Scale
高刚性琼脂糖微球离子交换介质
理论上来说，只要缓冲液pH值调节合适，所有的蛋白质都可以与阳离子交换柱和阴离子交换柱结合。但是，蛋白质纯化过程中，选择纯化条件和层析柱类型时最重要的考虑因素就是要保持蛋白质的稳定性。因此，选择哪一种离子交换层析和选择什么样的条件会影响蛋白质稳定性和活性是必须要考量的。通常，一些与某类离子交换层析相结合的条件可能对某种蛋白质比对其他蛋白质更为合适。
了解蛋白质等电点的知识可帮助寻找最合适的离子交换层析方法。以下在线工具可计算一个蛋白质的理论等电点 EXPASY。这些计算都完全基于蛋白质的氨基酸序列，不考虑其三维空间结构。而在实际情况中，一个蛋白质的某些残基可能暴露得比其他部分更多，所以，其实际pI和表面净电荷某些时候可能与理论计算值不尽相符 [19] 。氨基酸的相对位置分布同样会影响一个蛋白质的pI值 [20] ，而这一点在理论计算时同样未予考虑。有些技术可通过实验方法测得蛋白质实际的pI值，如等电聚焦电泳 [21] 、等电聚焦毛细管电泳 [22] 和高通量光学测量法等 [23] 。
蛋白质与IEX的结合必须采用较宽pH值范围的溶液进行多次尝试以获得最合适的蛋白质保留pH值。在pI值左右1个pH单位的溶液pH值通常认为是较合适的蛋白质结合pH值 [24] 。但是，在有些情况下，也可能需要在远离pI值的pH值条件下进行 [25] 。
图 3. 离子交换层析。蛋白质在低离子强度条件下与带电的固定相相结合。结合的蛋白质可以通过增加缓冲液的离子强度或者调节其pH值进行洗脱。
IEX的固定相是由惰性琼脂糖或者高分子基质与带电基团共价结合组成。介质微粒有很多尺寸，可以无孔，也可以有多种不同尺寸的孔。介质的选择主要根据所需的结合能力、分辨率和流速要求来决定。介质颗粒尺寸越小，分辨率越高，但相应的流速也越低，分离时间也更长。多孔介质比无孔介质的结合能力更强。无孔介质中，蛋白质不能进入树脂内部，因此相比多孔介质，前者的样品回收率更高，分辨率更高，分离时间也更短。一个研究表明，对于大多数蛋白质，采用无孔介质和多孔介质的分辨率和回收率都类似，但对于尺寸较大的蛋白质，多孔介质由于体积排阻效应而在分辨率上有一定损失 [26] 。
IEX中最常用的4种带电官能团如下所示。它们根据离子交换能力的强弱分类，强离子交换基团可离子化的pH范围比弱离子交换基团的范围更大。
阴离子交换 （固定相带正电）:
1、季铵（Q） - 强阴离子交换基团
2、二乙氨乙基（DEAE） -弱阴离子交换基团
阳离子交换 （固定相带负电）:
1、磺酸甲酯（S） -强阳离子交换基团
2、羧甲基（CM） - 弱阳离子交换基团
因为强离子交换基团的活性基团在很大的pH范围内均可保持带电，它可以在蛋白质结合所需pH值是特别强的酸性或碱性的情况下使用（假设该pH值下蛋白质稳定性仍得以保持）, [27] 。有些蛋白质在弱离子交换上的保留较弱，使得它们可以用较低的离子强度洗脱 [28] 。由于高离子强度会影响部分蛋白质的稳定性 [29] ，而弱离子交换不需要在极端的pH值条件下进行蛋白质的结合，因此可能对蛋白质更合适。
离子交换色谱的固定相首先用低离子强度的缓冲液平衡，然后将蛋白质样品用和平衡过程相同离子强度的缓冲液上样到固定相。结合的蛋白质在用更高离子强度或pH值不同（图6）的缓冲液洗脱前先淋洗一段时间。洗脱缓冲液中的抗衡离子与带电的固定相相互作用，取代了柱上的蛋白质。在离子交换层析中，某些盐类代替结合蛋白和保持蛋白质稳定性的能力，可能比其他种类的盐可能更有效 [30] 。NaCl或KCl是洗脱液中最常用的盐类，其中Na+或K+是阳离子交换层析中的抗衡离子，Cl-是阴离子交换层析中的抗衡离子。另一方面，还可以通过调节缓冲液的pH值来减少蛋白质的电荷并破坏其与固定相之间的相互作用。对于结合到阳离子交换固定相上的蛋白质，增加缓冲液pH值会使蛋白质所带正电荷减少，因此可将其从柱上洗脱下来。对于结合到阴离子交换固定相上的蛋白质，降低pH值可减少蛋白质所带负电荷将其从柱上洗脱下来。
同时，还可以调节缓冲液的pH值使目标蛋白质不与离子交换固定相相结合，而与此同时杂蛋白与固定相结合。如此，可在穿透液中收集目标蛋白质，而杂蛋白通过与固定相结合得以去除。
与其他层析方法相比，离子交换层析在确定蛋白质结合、洗脱和获得足够高的分辨率的最佳条件时可能需要解决更多的问题。
疏水层析
疏水作用层析（HIC）分离蛋白质主要是基于它们疏水性的不同。它常在蛋白质纯化工艺的中期使用。在HIC中，蛋白质在高离子强度的缓冲液中与固定相结合，因此，无需更换缓冲液或者洗脱液即可在离子交换色谱之后直接应用HIC。同样，HIC也可以跟在通过用盐类沉淀快速去除部分而非全部蛋白质的硫酸铵沉淀步骤之后实施。HIC有时在纯化工艺的前期使用，有时也作为最后一个步骤来去除目标蛋白中的微量杂质。
溶液中存在的盐离子可能导致蛋白质的部分去折叠，暴露出部分常规情况下隐藏于内部的疏水残基。当加入离子强度较低的缓冲液时，结合到固定相的蛋白质恢复到原折叠结构。由此，可减少其可与固定相相互作用的疏水残基的暴露，有利于蛋白质从固定相上洗脱下来。因为蛋白质可以随着离子强度的降低而自动地再折叠回原结构，所以HIC是一种非常有价值的一种蛋白质纯化手段。
图 4. 逐渐降低盐（硫酸铵）浓度梯度从疏水柱上洗脱下的蛋白质。收集的组分需进行蛋白浓度和目标蛋白特异性活性的检测。根据蛋白质活性检测结果，目标蛋白的浓度在第45组组分中达到最高。
离子强度应该尽量低，使其可以促使目标蛋白结合，同时又不会导致蛋白质沉淀。如果结合所需离子强度高到导致目标蛋白的沉淀，可以使用略低的离子强度。这种情况下，层析过程可以将所有结合蛋白质与穿透的未结合目标蛋白分离开。
Phenyl Seplife FF(HS)
琼脂糖微球疏水层析介质
在层析柱上样前，固定相必须用高离子强度的缓冲盐平衡（蛋白质样品所使用的相同的缓冲液），然后柱上上样，并淋洗一段时间后，再用较低离子强度的缓冲液将蛋白质洗脱（图 7、8）。
图 5. 疏水作用层析。在高离子强度下，蛋白质部分去溶剂化，使其通常隐藏在内部的疏水部分更多地暴露出来。这些残基会与介质上的疏水官能团发生疏水相互作用。降低离子强度可以使蛋白质重新隐藏其疏水部分，折叠回复原结构。这会降低蛋白质与固定相之间的疏水相互作用，完成蛋白质的洗脱。
疏水作用层析的固定相是由交联的琼脂糖或合成的共聚高分子的骨架组成。骨架上共价连接上烷基或者芳香基的配体，以便与疏水性分子产生特异性相互作用。
官能团的种类包括：
1、烷基 - 不同长度的碳氢链结构，通常为丁基或者辛基。固定相的结合能力随着烷基链的增长而增加 [31] 。官能团结合蛋白的能力主要是基于蛋白质的疏水性
2、芳香基 - 一种由芳环衍生而来的官能团，通常为苄基。芳香基的特异性通常更高，因为蛋白质还可以通过基本的堆积作用与该官能团相互作用。
每一种蛋白的结合和洗脱缓冲液所用盐的种类和浓度都应经由实际实验确定。此外，蛋白质的再折叠和活性在洗脱后都必须得到保证。
和其他柱层析类似，优化HIC工艺时也需要解决大量的问题。每一种蛋白都需要调节缓冲液条件和固定相以保证获得最优化的分离。
凝胶过滤层析
凝胶过滤又称为分子筛及体积排阻，体积排阻层析是根据蛋白质具有不同的水力学半径将它们进行分离，该数据主要通过测量分子尺寸和形状两方面信息获得。与上述其他层析过程不同的是，蛋白质不与SEC的固定相相结合，而是依靠它们通过惰性固定相的速度不同来完成分离。
图 9. 三种不同水力学半径的蛋白质混合物用体积排阻色谱柱分离。大蛋白因为不能进入介质孔道内部而只能直接流经柱体最先流出。稍小的蛋白质会进入介质孔道内部，流经的路径更复杂，因此需要更多的时间来穿过介质并流出柱体
基于SEC可分辨不同种类蛋白的能力，它通常是一种用于最后一步纯化的有效方法。低聚物 [32] 、去折叠的蛋白分子 [33] 和缺失蛋白 [34] 都可以在逐渐置换缓冲液的过程中与结构完整的天然蛋白质分子分离开。通常，由于SEC可使用溶剂种类更多，所用的缓冲盐也更少，因此比透析的缓冲液置换过程更快也更可靠。整个SEC过程都只使用一种溶剂，而市购的SEC固定相几乎与所有常规的缓冲液兼容。
固定相的类型和柱子的长度对蛋白质的SEC分离的分辨率有很大的影响。市场上有很多种固定相可选，其选择最好是根据待分离蛋白质分子的分子量和分离条件两方面来决定。
Seplife 6FF
超螺旋质粒，病毒等凝胶过滤层析分离介质
与其他层析方法一样，SEC同样既有优点也有缺点。是否采用SEC要取决于蛋白质本身及其后续应用的要求。
SEC的优点：
1、可进行缓冲液交换和脱盐。
2、可分离其他纯化技术难以分离的相似品种（如蛋白片段和低聚物）。
3、可与多种溶剂相容。
4、不依赖于蛋白质的任何一种特殊形式进行保留和洗脱。
SEC的缺点:
1、分离效果严重依赖柱子的填装效果。
2、蛋白质与介质间有非特异性相互作用，会降低分辨率。
3、对复杂的蛋白质混合物分辨率低。
4、为保证足够的分辨率，上样量必须较小。这对沉淀得到的高浓度蛋白质是一个问题。
要优化SEC条件以获得最好的分离效果，常常需要耗费大量时间，而一些因素会对分离效果产生非常大的影响。
提高SEC分离效果的条件:
1、上样体积尽量最小。上样体积越小，洗脱组分的扩散将会越弱。
2、缓冲液中加盐。少量的盐有助于防止蛋白质与固定相间的非特异性相互作用。这将保证所有的蛋白质可以稳定地流过整个层析柱。
3、采用合适的流速。流速过快使得小分子没有足够的时间流经介质孔道，流速过慢则会导致样品扩散时间增加。
4、保证样品和溶剂的黏度接近。调整样品的条件使其与洗脱缓冲液的类似。
5、调整层析柱长度。柱子过短使蛋白质分离不充分。而柱子过长则使得蛋白质样品扩散严重。
6、重装柱子。柱子的填装效果会蛋白质的分离效果有相当大的影响。
如果介质颗粒没有分布均匀或者填装时带入气泡，蛋白质将不能顺利地流过固定相。此外，如果柱子跑干了，就必须重装。柱子填装不好通常就是分离效果不好的原因。
由于SEC并不是基于蛋白质官能团间的相互作用来进行分离，所有的蛋白质都在相同的条件下进行洗脱，所以分离效果仅仅依赖于蛋白质各自不同的水力学半径。因此，SEC通常不适合在含有较多杂蛋白的纯化工艺前期使用。但是，SEC又可作为一种快速可靠的样品脱盐或者小分子去除方法用于分离工艺前或中期。在纯化的最后阶段，当只剩痕量杂蛋白时，SEC则是一种蛋白质分离和置换保存缓冲液的有效方法。
蛋白质洗脱方法
固定相上结合的蛋白质要用可破坏结合作用力的溶剂条件进行洗脱。这些流动相的条件要根据层析类型和目标蛋白质的性质来选择。蛋白质洗脱方法通常包括以下三种：批次洗脱，阶梯式洗脱和线性梯度洗脱。如何选择最好的方法要依靠采用的层析方式和所需的分离效果来决定。
1、批次洗脱 - 一步即将所有结合蛋白质一次性洗脱。基于特异性相互作用 （如亲层析）的层析方法最好采用这种方式。批次洗脱法没有任何分离效果，但它可以很好地快速去除杂质。它需要事先了解取代目标蛋白所需的缓冲液条件。
2、阶梯式洗脱 - 连续进行多步批次洗脱，并每次逐渐增强洗脱条件。在阶梯式洗脱中，收集的组分数取决于连续批次洗脱的次数。阶梯式洗脱比批次洗脱的分离效果要好，但比线性梯度洗脱的效果要差。
3、线性梯度洗脱 - 当流动相以线性梯度洗脱时可收集多种连续流出的组分。对于离子交换层析和疏水作用层析，线性梯度洗脱可以获得最好的分离效果，同时，它还可以收集到大量的连续组分。
由于体积排阻层析中蛋白质和固定相之间不存在相互作用，因此不需要采用任何一种上述洗脱方法。蛋白质上样后，无需改变洗脱缓冲液的条件，即可连续不断地收集各分离组分至所有蛋白质全部被洗脱为止
理想的情况是这根层析柱所采用的洗脱缓冲液同样可用于后续的层析柱，由此可省去两步之间必须的缓冲液置换或者透析操作。
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